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脂肪酸β氧化過程（β-oxidation）在動物組織的線粒體發(fā)生的脂肪酸代謝通路，可概括為活化、轉(zhuǎn)移、β氧化及最后經(jīng)三羧酸循環(huán)被徹底氧化生成CO2和H2O，并釋放能量等四個階段。短鏈烯脂酰輔酶A水合酶（short chain enoyl coA hydratase；ECHS；EC4.2.1.17），又稱為巴豆酸酶（crotonase），是脂肪酸代謝進(jìn)入β-氧化后的第二步催化反應(yīng)，也是為第二次脂肪酸氧化做準(zhǔn)備。短鏈烯脂酰輔酶A水合酶是一種存在于線粒體和過氧化物體的內(nèi)膜上的可溶型蛋白，常作為多功能蛋白（multi-functional protein），包括水合酶、異構(gòu)酶和脫氫酶的一員。在細(xì)菌中，還參與聚羥基烷酸酯（Polyhydroxyalkanoate；PHA）的合成。豬的短鏈烯脂酰輔酶A水合酶由6個亞體構(gòu)成，155Kd。在烯脂酰輔酶A水合酶的催化下，將脂酰輔酶A，即烯脂酰輔酶A（trans-△^2,3-enoyl CoA）上2和3位碳之間的雙鍵（double bond）裂解，加上OH基團(tuán)和質(zhì)子到未飽和脂肪酸脂酰輔酶A的β-碳位上。基于短鏈烯脂酰輔酶A 4碳巴豆酰輔酶A（crotonyl-CoA）作為底物，在短鏈烯脂酰輔酶A水合酶的作用下，產(chǎn)生羥脂酰輔酶A （L-3-hydroxyacyl coA）衍生物。由此烯脂酰輔酶A之間的烯硫脂鍵（enoyl-thiol ester bond）丟失，在分光光度儀下，發(fā)生峰值變化（263nm 波長），來定量分析短鏈烯脂酰輔酶A水合酶的活性。短鏈烯脂酰輔酶A水合酶反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
ECHS 
Crotonyl CoA  +  H2O   →   L-3-hydroxyacyl-CoA  
                              
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）  60毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）  10毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）   5毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D） 500微升
HEPENGBIO陰性液（Reagent E）     1毫升
產(chǎn)品說明書      1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）和HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）避免光照；有效保證6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿或96孔板：用于光度分析的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光度分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
一、 樣品準(zhǔn)備
 
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重200至500毫克
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗
4． （選擇步驟）抽去清理液
5． 移入到一個液氮凍存管
6． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
8． 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
9． 加入置于冰槽里的200至500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 
10． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11． 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/em>）
12． 即刻放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
13． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
15． 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
 
二、 測定準(zhǔn)備
 
1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長263nm，間隔5分鐘，讀數(shù)4次（共15分鐘），并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）避免光照
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
 
三、 背景對照測定
 
1． 移取220微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入25微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 上下傾倒數(shù)次，混勻
4． 在30℃溫度下孵育3分鐘
5． 加入5微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數(shù)－15分鐘讀數(shù)）
 
四、 樣品測定
 
1． 移取220微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入25微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 上下傾倒數(shù)次，混勻
4． 在30℃溫度下孵育3分鐘
5． 加入5微升待測樣品（100微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－15分鐘讀數(shù)）
 
五、計算樣品活性
 
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.7（毫摩爾吸光系數(shù)）X 15（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升 
 
轉(zhuǎn)換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
 
單位＝微摩爾長鏈烯脂酰輔酶A /分鐘
 
六、 酶標(biāo)儀測定
 
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
2． 分別移取220微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3． 分別加入25微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
4． 輕輕搖動96孔板
5． 在30℃溫度下孵育3分鐘
6． 分別加入5微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）或待測樣品（20微克總蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
7． 輕輕搖動96孔板
8． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)
9． 活性計算：
 
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.7（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 15（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升 
 
轉(zhuǎn)換：單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
 
單位＝微摩爾長鏈烯脂酰輔酶A /分鐘 
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4． 建議使用比色皿測定
5． 樣品須澄清，至關(guān)重要
6． 加樣后3秒內(nèi)光度測定
7． 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)15分鐘
8． 光度測定后，比色皿須清洗徹底
9． 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于15分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
10． 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升
11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
12． 用戶可以使用短鏈鏈烯脂酰輔酶A水合酶抑制劑8碳烯脂酰輔酶A（2-octenoyl CoA；4.5微摩爾）作為陰性對照或抑制劑陽性對照
13． 牛的心臟組織短鏈鏈烯脂酰輔酶A水合酶活性參考值為145微摩爾/分鐘/克，肝臟組織為717微摩爾/分鐘/克
14． 短鏈鏈烯脂酰輔酶A水合酶單位活性定義為：在30℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1微摩爾巴豆酰輔酶A所需的酶量作為一個活性單位