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腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），簡(jiǎn)稱腺苷，包括單磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一種單體單位，為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）的組成成分，并提供化學(xué)能量，在能量代謝通路中維護(hù)諸如肌肉、胞膜等組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生化和生理功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞糖酵解、三羧酸循環(huán)、電子傳遞系統(tǒng)、氧化磷酸化活動(dòng)。腺嘌呤核苷酸在細(xì)胞中濃度低，且不穩(wěn)定，通常通過(guò)其類(lèi)型不同、濃度差異、分布狀況，來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的代謝情況和能量狀態(tài)。單磷酸腺苷（Adenosine monophosphate；AMP），又稱為5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5'-adenylic acid），是一種在（脫氧）核糖核酸中發(fā)現(xiàn)的核苷酸。它是一種磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基團(tuán)、戊糖核酸糖及堿基腺嘌呤所組成。分子式為C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通過(guò)腺苷酸激酶（adenylate kinase）催化2分子ADP生成，或通過(guò)ATP以及ADP水解產(chǎn)生。AMP常以腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸（cAMP）形式存在于細(xì)胞中。AMP與ATP之比反映細(xì)胞ATP生成狀況以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），參與ADP-ATP循環(huán)，提供熱能轉(zhuǎn)換和動(dòng)態(tài)平衡，尤其在線粒體需氧呼吸、光合成等實(shí)現(xiàn)。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代謝活躍的細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞活力的標(biāo)志。一旦細(xì)胞凋亡或壞死，ATP濃度急遽下降。通過(guò)高氯酸酸性處理，排除蛋白質(zhì)干擾，堿性中和后，在高效液相色譜儀和紫外光度儀下（254nm波長(zhǎng)）檢測(cè)分析，分離出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HPBIO清理液（Reagent A）       60毫升
HPBIO裂解液（Reagent B）  10毫升
HPBIO酸性液（Reagent C）        1毫升
HPBIO中和液（Reagent D）     2毫升
HPBIO流相液A（Reagent E）      500毫升
HPBIO流相液B（Reagent F）      500毫升
HPBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G） 500微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份
 
 
 
 
保存方式
 
保存HPBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；HPBIO酸性液（Reagent C）和HPBIO中和液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月
 
用戶自備
 
HANK平衡鹽緩沖溶液（HPBIO12028）或PBS緩沖溶液（HPBIO12033）：用于清理細(xì)胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HPBIO12024）：用于細(xì)胞脫離
完全細(xì)胞培養(yǎng)液（HPBIO12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞
高效液相色譜儀（HPLC）：用于定量測(cè)定
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
一、 樣品準(zhǔn)備 
 
1． 準(zhǔn)備1瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（1 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
2． 加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
3． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
4． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
5． 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，
6． 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
7． 移入一個(gè)50毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從此步驟開(kāi)始）
8． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
9． 小心抽去上清液
10． 加入3毫升預(yù)冷的HPBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
11． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
12． 小心抽去上清液
13． 加入500微升預(yù)冷的HPBIO裂解液（Reagent B）
14． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
15． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
16． 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約40下）
17． 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
18． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
19． 小心移取360微升上清液到1.5毫升離心管
1． 加入40微升預(yù)冷的HPBIO酸性液（Reagent C）
2． 渦旋震蕩1分鐘
3． 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
4． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)再次離心10分鐘，速度為6000g
5． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
6． 加入62微升HPBIO中和液（Reagent D），充分混勻
7． 置于冰槽里靜置30分鐘
8． 即刻移入上清液到新的1.5毫升離心管（注意：避免移取沉淀顆粒）
20． 放進(jìn)－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待測(cè)
 
二、測(cè)定準(zhǔn)備
 
1． 開(kāi)啟儀器預(yù)熱15分鐘
2． 根據(jù)下表設(shè)置高效液相色譜儀（HPLC）參數(shù)
 
 

參數(shù)	推薦	補(bǔ)充說(shuō)明
色譜柱	長(zhǎng)度：25cm 直徑：4.6mm	Waters儀器或 Agilent儀器
固定相	ODS
流動(dòng)相	HPBIO流相液A（Reagent E）和HPBIO流相液B（Reagent F）	參見(jiàn)運(yùn)行程序
流速	1.3毫升/分鐘
注射容量	50微升	10微升至100微升
檢測(cè)	紫外
波長(zhǎng)	254nm
柱溫	25℃
出峰時(shí)間（retention）	5.6分鐘（ATP）；6.5分鐘（ADP）；10分鐘(AMP)	參考
運(yùn)行時(shí)間	15分鐘	參考

 
3． 運(yùn)行程序
 

運(yùn)行時(shí)段	程序	時(shí)間
開(kāi)機(jī)后預(yù)運(yùn)行	100% HPBIO流相液A（Reagent E）	總10分鐘
檢測(cè)運(yùn)行時(shí)段	100% HPBIO流相液A（Reagent E） 0%HPBIO流相液B（Reagent F）	0至9分鐘
	100% HPBIO流相液A（Reagent E）至 75% HPBIO流相液A（Reagent E） 0%HPBIO流相液B（Reagent F）至25%HPBIO流相液B（Reagent F）	9至15分鐘
關(guān)機(jī)前運(yùn)行	100% HPBIO流相液A（Reagent E） 0%HPBIO流相液B（Reagent F）	總10分鐘

 
三、 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制
 
1． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
2． 分別加入100微升HPBIO流相液A（Reagent E）到1至5號(hào)管
3． 移取100微升HPBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到1號(hào)管，混勻
4． 小心移取100微升1號(hào)管稀釋的HPBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到2號(hào)管，混勻
5． 小心移取100微升2號(hào)管稀釋的HPBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到3號(hào)管，混勻
6． 小心移取100微升3號(hào)管稀釋的HPBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到4號(hào)管，混勻
7． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表
 

管號(hào)	HPBIO流相液A（Reagent E）	HPBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）	標(biāo)準(zhǔn)ATP/ADP/AMP濃度
1	100微升	100微升	100微摩爾/升
2	100微升	100微升1號(hào)管	50微摩爾/升
3	100微升	100微升2號(hào)管	25微摩爾/升
4	100微升	100微升3號(hào)管	12.5微摩爾/升
5	100微升	0	0

 
四、色譜分析
 
1． 將上述配制的HPBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）和待測(cè)樣品放進(jìn)冰槽里等待
2． 每次（每個(gè)樣品）注射50微升
3． 按照檢測(cè)運(yùn)行程序每次（每個(gè)樣品）運(yùn)行15分鐘
4． 獲得色譜波峰圖：波峰面積（peak area）或峰值，保存記錄
 
五、計(jì)算樣本ATP/ADP/AMP濃度
 
1． 方法一：通過(guò)儀器中的軟件進(jìn)行測(cè)算
2． 方法二：構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為波峰面積（peak area）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)ATP/ADP/AMP濃度（微摩爾/升），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)ATP/ADP/AMP濃度（微摩爾/升）
3． 方法三：公式計(jì)算（選擇單一濃度的標(biāo)準(zhǔn)液）
 
樣本ATP/ADP/AMP濃度（微摩爾/升）=【樣本波峰面積（peak area）X標(biāo)準(zhǔn)ATP/ADP/AMP濃度】÷對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)ATP/ADP/AMP濃度的波峰面積